GST融合蛋白纯化试剂盒实验中容易遇到的问题

 

GST标签蛋白不结合柱子或结合非常弱

问题

可能原因

解决方法

GST标签蛋白不结合柱子或结合非常弱

 

GST标签蛋白被机械裂解的方法变性(比如超声)。过分的裂解会使标签蛋白变性,阻止其结合。

在裂解的过程中,用温和的机械/化学裂解条件。裂解的条件必须依照经验来决定。

GST标签蛋白在样品中有聚焦,导致沉淀

在细胞裂解前加入DTT,在缓冲液中也加入DTT。1-20mM的DTT会显著增加某些GST蛋白的结合。

标签蛋白的浓度过低

浓缩样品。结合能力是浓度依赖的。低表达量的蛋白可能不会像高表达量蛋白那样有效的结合柱子。因此,浓缩样品会提高结合。

标签蛋白可能改变了GST的构象,因此降低了GST标签蛋白的结合能力。

检测所使用的pGEX载体中GST的结合。准备带有所使用的pGEX的细胞超声裂解物,检测其与柱材的结合。如果结合的很好,则可能是标签蛋白改变了GST的构象,因此降低了GST标签蛋白的亲和力。可以通过降低结合的温度到4℃限制洗涤来改善结果。

平衡时间太短

确认柱材至少用5倍柱体积的pH6.5到8.0的缓冲液平衡过(比如PBS)。

GST标签蛋白在pH值低于6.5和高于8时结合效率低

在净化好的样品上样前用pH6.5到8.0的缓冲液平衡过(比如PBS)。

GSTrap柱:柱子需要清洗

根据标准的清洗步骤清洗柱子。如果GSTrap柱已经用过几次了,可能需要更换用新柱。

Glutathione Sepharose柱材使用次数过多

使用新的Glutathione Sepharose柱材。

样品上样过程中的流速过高

降低在上样时的流速。影响GST标签蛋白的一个重要参数就是流速。由于GST与谷胱甘肽相对慢的结合,在样品上样过程中保持低流速以获得最大结合能力很重要。

在AKTAprime plus上的GSTrap柱:柱子或系统被堵住了,导致高压力和无结合。

柱子堵住了:根据说明书清洁柱子,确认样品已经离心或用0.45um的滤膜过滤过了。

系统堵住了:将柱子换成一段管子。如果压力高于0.3MPa,根据手册清洗系统。

在AKTAprime plus上的GSTrap柱:样品不结合

检测是否使用了正确的柱子。

检测流入管是否接入了正确的流入端口。

检测缓冲液的组成和pH值是否正确。检测样品是否已经被调节到适合结合缓冲液的条件。

 

GST标签蛋白不能被高效的洗脱

问题

可能原因

解决方法

GST标签蛋白不

能被高效的洗脱

洗脱缓冲液的体积不够

增加洗脱缓冲液的体积。有些情况下,尤其是柱上酶切有标签蛋白时,需要更大体积的缓冲液来洗脱标签蛋白。

洗脱的时间不够

通过降低洗脱过程中的流速来增加洗脱时间。

对于GSTrap柱,为了获得最好的结果,在样品上样时,用0.2到1ml/min的流速(1ml HiTrap柱),0.5到5ml/min的流速(5ml HiTrap柱)。对于离心方法,降低洗脱过程中的离心速度。

谷胱甘肽的浓度不够

增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度:本方案中建议的10mM浓度相对于大多数应用来说足够了,但是也存在例外。尝试使用50mM Tris-HCI,20-40mM还原型谷胱甘肽,pH8.0作为洗脱缓冲液。

洗脱缓冲液的pH过低

增加洗脱缓冲液的pH值:将pH值增加到8-9会增强洗脱而不用提高洗脱所用谷胱甘肽的浓度。

洗脱缓冲液的离子强度过低

增加洗脱缓冲液中的离子强度,在洗脱缓冲液中加入0.1-0.2M的氯化钠也会使结果变好。

洗脱缓冲液中的谷胱甘肽被氧化了

使用新鲜的洗脱缓冲液。

加入DTT

非特异的疏水相互作用导致蛋白和柱材非特异的结合或聚集,从而阻止了标签蛋白的溶解和洗脱

向洗脱缓冲液中加入非离子去垢剂。加入1%的TritonX-100或2%的n-octylglucoside可以显著提高某些GST标签蛋白的洗脱。

 

电泳或蛋白质免疫印迹检测发现

问题

可能原因

解决方法

电泳或蛋白质免

疫印迹检测发现

多条条带

分子量为70000的蛋白与GST

标签蛋白共纯化

分 子量为70000的蛋白可能是大肠杆菌dnak基因的产物。该蛋白参与大肠杆菌中蛋白质折叠。有报道这种相互作用可以通过上样前在50mM Tris- HCI,2mM ATP,10mM MgSO4,pH7.4中37℃温浴10分钟而破坏。或者把有标签蛋白通过ATP-agarose或相似的纯化介 质 进行离子交换层析来除去。

标签蛋白被蛋白酶部分降解

加 入蛋白酶抑制剂。多条条带可能是由于目的蛋白被蛋白酶部分降解的结果。在裂解溶液中加入1mM PMSF可能会使结果变好。一种无毒的水溶性的PMSF替 代物是AEBSF,Roche Biochemicals的商品名为Pefabloc SC。注:丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa前除 去。Prescission Protease不是一种经典的丝氨酸蛋白酶。经GEHealthcare检测,它对很多蛋白酶抑制剂不敏感。

PMSF有毒,有急性作用。如果可能的话使用Pefabloc SC。

在宿主细菌中的蛋白降解

用一种蛋白酶缺失型宿主:多条带可能是在宿主细菌中蛋白酶切造成的。如果是这种情况,或许需要蛋白酶缺陷型菌株(比如lon-或ompT)大肠杆菌BL21随pGEX载体提供。

这种菌株是ompT和lon缺陷型菌株。

在机械裂解过程中细胞破碎

 

 

降 低裂解时间:细胞裂解表面上是使浑浊液部分澄清,可以通过镜检检测。机械裂解前加入溶菌酶(0.1倍体积的10mg/ml溶菌酶溶液,溶菌酶保存在 25mM Tris-HCI,pH8.0)可能会使结果变好。避免发泡,因为这可能使标签蛋白变性。过分裂解也会导致宿主细胞蛋白和GST标签蛋白共纯 化。

分子伴侣可能被共纯化了

 

 

包 括额外的纯化步骤:多余的条带可能由于共纯化一些分子伴侣所造成。这些分子伴侣参与大肠杆菌中新生成的蛋白的正确折叠。这些包括,但不仅仅 是:Dnak (分子量70000)DnaJ(分子量37000)GrpE(分子量40000)GroEL(分子量57000)GroES(分子量 10000)。一些从这些共纯化的蛋白中分离GST标签蛋白的方法已经发表。

抗体和很多种大肠杆菌中的蛋白反应

 

 

抗体和大肠杆菌蛋白交叉反应:取决于抗GST抗体的来源。它可能包含一些抗体,这些抗体与标签蛋白样品中的大肠杆菌蛋白能够反应。通过和大肠杆菌的超声裂解物反应来除掉和大肠杆菌蛋白进行过交叉吸附,并检测证明其在蛋白质免疫印迹中没有非特异条带。

 

目的蛋白酶切后电泳检测发现多条条带

问题

可能原因

解决方法

目的蛋白酶切后

电泳检测发现多

条条带

蛋白酶切发生在宿主细菌内

检测条带何时出现:确定多余的条带在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在。这些条带可能是在宿主细菌中降解的结果。

目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa的切割位点,检查序列。