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纯化抗体效价测定法来源:《现代免疫化学技术》 1、当抗体浓度在5mg/ml以上,可用免疫双相扩散法测定抗体效价。 2、当抗体浓度低于3mg/ml时,或者对应抗原为小分子(如生物素,地高辛等)时必须用ELISA法测定抗体活性,同上步骤。
操作步骤如下: 1、1%离子琼脂配制及倒板: 称1g琼脂糖或日本琼脂粉,加入100ml 0.05U pH8.6巴比妥-HCL缓冲液中,水浴下加热至完全融化,取3ml倒在普通载玻片上(2.5×7cm),待凝胶凝固后,放4℃存放20min以上可打孔使用。 待用琼脂凝胶加入20mg NaN3,混匀后3ml-分装于4℃保存备用。 2、打孔加样。 用3mm打孔器打孔,孔径3mm,孔距3~5mm的梅花瓣孔图。注意不要把孔打裂,及漏底现象。 当测抗体效价或活性时,抗体对倍稀释后加在四周孔,抗原加在中间孔,每孔10μl。 各种IgG抗体,对应抗原可用正常血清1:40~50PBS稀释作抗原。 3、结果观察 加好样品的双扩板,放37℃温箱24~48小时,观察结果,**对着日光灯观察。**稀 释度抗体孔的沉淀线为抗体效价或活性。
琼脂双相扩散图 沉淀线随着抗体的稀释,逐渐靠近抗体孔边。 (五)单相免疫扩散法:参考“现代免疫化学技术”第185~187页 (六)免疫电泳法:参考“现代免疫化学技术”第52~62页 (七)免疫印迹技术参考“现代免疫化学技术”第83~87页。 (八)纯化抗体及免疫球蛋白IgG 的定量均采用紫外吸收公式计算 IgG(或纯化抗体IgG)mg/ml=×稀释倍数 IgG消光系数=1cm光程,1mg/ml浓度0.01mol/L pH7.2PBS的OD吸收值。
不同血清IgG的消光系数为:羊IgG:1.30,兔IgG:1.35,人IgG:1.38,小鼠IgG:1.46,
大鼠IgG:1.45,马 IgG:1.50,猪 IgG:1.42,狗 IgG:1.58,鸡 IgG:1.77 |